Nedavni napredak u membranama za uklanjanje virusa za pročišćavanje antitijela

Virusi su mikroskopske parazitske čestice koje postoje u okolišu-uključujući vodu, zrak, tlo-i unutar živih organizama. Oni su odgovorni za širok spektar zaraznih bolesti i uzrokuju hiljade smrti širom svijeta svake godine. Zbog svoje male veličine (20-200 nm), izuzetne stabilnosti u okolini, niske infektivne doze i potencijala za-prenos na velike udaljenosti, virusi predstavljaju značajan rizik po biološku sigurnost.

Kako bi se smanjio rizik od virusne kontaminacije u biofarmaceutskim proizvodima, neophodno je uspostaviti robusne, efikasne i pouzdane strategije uklanjanja virusa u toku proizvodnog procesa.

Konvencionalne metode inaktivacije i uklanjanja virusa uključuju inkubaciju sa niskim-pH, tretman rastvaračem/deterdžentom (S/D), zračenje i membransku filtraciju. Međutim, svaka tehnika ima inherentna ograničenja. Tretman sa niskim-pH može ugroziti stabilnost rekombinantnih proteina, dok je tretman rastvaračem/deterdžentom efikasan samo protiv virusa sa omotačem i pruža ograničenu zaštitu od virusa bez omotača -. Isto tako, ultraljubičasto (UV) i gama ( ) zračenje može oštetiti ćelije, proteine ​​ili druge biološki aktivne supstance.

 

Među trenutnim tehnologijama uklanjanja virusa, membranska filtracija se pojavila kao jedan od pristupa koji najviše obećava. Učinkovito uklanja viruse u širokom rasponu veličina uz održavanje odlične tolerancije na različite fizičke i kemijske uvjete obrade. Nanofiltracija je postala standardni korak uklanjanja virusa u proizvodnji proizvoda-izvedenih iz plazme, posebno za male viruse kao što je parvovirus B19. Ova tehnologija je pokazala visoku efikasnost uklanjanja protiv brojnih modelnih virusa, uključujući virus ljudske imunodeficijencije (HIV), virus goveđe virusne dijareje (BVDV), virus pseudorabiesa (PRV), pasji parvovirus (CPV), virus encefalomiokarditisa (EMCV) i virus hepatitisa A (HAV).

Ovaj pregled rezimira trenutno razumijevanje mehanizama filtracije virusa, nedavna dostignuća u membranskim materijalima za uklanjanje virusa i glavne izazove i buduće izglede tehnologija filtracije virusa zasnovanih na membrani{0}}u pročišćavanju antitijela.

 

 

 

1. Mehanizmi razdvajanja membrana za uklanjanje virusa

Učinkom membrana za uklanjanje virusa upravlja složena interakcija između veličine pora membrane, svojstava površine i elektrostatičkih interakcija s virusnim česticama. Integracijom isključivanja veličine, elektrostatičkog odbijanja i adsorpcionih mehanizama, membrane za uklanjanje virusa efikasno hvataju i zadržavaju virusne kontaminante, dok dozvoljavaju ciljnim biomolekulima da prođu.

1.1 Isključivanje veličine

Isključivanje veličine je jedan od najčešće prihvaćenih mehanizama za uklanjanje virusa zbog njegove visoke selektivnosti i efikasnosti filtracije (Slika 1).

Pažljivom kontrolom veličine pore na membrani, virusi različitih dimenzija mogu se efikasno odvojiti, čime se osigurava visoka čistoća proizvoda. Nadalje, ovaj mehanizam ne zahtijeva dodavanje hemijskih reagensa, eliminirajući rizik od hemijske kontaminacije ili zaostalih nečistoća u finalnom proizvodu.

Ove prednosti čine isključenje veličine idealnom strategijom uklanjanja virusa za biofarmaceutsku proizvodnju, posebno u proizvodnji terapijskih proteina, monoklonskih antitijela, vakcina i drugih bioloških proizvoda.

Slika 1. Uklanjanje virusa pomoću mehanizma isključivanja veličine

 

1.2 Elektrostatička interakcija

Elektrostatička interakcija predstavlja još jedan važan mehanizam razdvajanja virusa i široko se koristi za hvatanje i uklanjanje virusa (Slika 2).

Ovaj pristup iskorištava razlike u adsorpcijskim silama između materijala membrane i virusnih čestica. Prilagođavanjem svojstava površine membrane, virusi se mogu efikasno uhvatiti putem elektrostatičke privlačnosti.

Tipični materijali za elektrostatičku filtraciju uključuju nanofibrozne membrane, porozne materijale i funkcionalizirane nanomaterijale. Zbog svoje velike specifične površine i obilnih funkcionalnih grupa, ovi materijali pružaju brojna aktivna mjesta vezivanja koja poboljšavaju interakciju s virusnim česticama i poboljšavaju zadržavanje virusa.

 

Istraživanja su pokazala da nekoliko radnih uvjeta značajno utječe na učinak uklanjanja elektrostatičkih virusa:

1. Nizak pH i niska jonska snaga maksimiziraju zadržavanje virusa jačanjem elektrostatičke interakcije između površine membrane i virusnih čestica.

2. Dvovalentni katjoni, kao što su Mg²⁺ i Ca²⁺, mogu smanjiti efikasnost uklanjanja virusa slabljenjem elektrostatičkih interakcija.

3. Tokom prekida protoka, zadržavanje virusa zavisi prvenstveno od elektrostatičke privlačnosti i hidrofobne adsorpcije između membrane i bakteriofaga PP7. Pod ovim uslovima, membrane za uklanjanje virusa sa niskim proteinskim afinitetom generalno pokazuju niže performanse Log Reduction Value (LRV).

Slika 2. Mehanizam elektrostatičke interakcije u filtriranju virusa

Sa brzim rastom biofarmaceutske industrije, filtracija virusa postaje sve kritičniji korak u prečišćavanju i proizvodnji bioloških lijekova. Međutim, konvencionalne membrane za filtriranje virusa često su ograničene nedovoljnim protokom permeata, neadekvatnom dugotrajnom-stabilnošću i visokom osjetljivošću na onečišćenje membrane, što sve može ugroziti performanse procesa i prinos proizvoda.

Kako bi odgovorili na ove izazove, istraživači su uložili značajne napore u razvoj membranskih materijala sljedeće-generacije s poboljšanom efikasnošću filtracije, poboljšanom otpornošću na prljanje i vrhunskom operativnom stabilnošću.

Nedavni napredak uključuje:

1. Zwitterionic SPP- cijepljene polietersulfonske (PES) ultrafiltracione membrane, koje poboljšavaju hidrofilnost membrane i smanjuju adsorpciju proteina.

2. Mikroporozne PES membrane cijepljene četkicama od zwitterionskih polimera, koje pružaju poboljšane performanse protiv obraštanja uz održavanje visokog zadržavanja virusa.

3. Mikrofiltracione membrane na bazi PAN/PET celuloze{1}}, koje nude odličnu mehaničku čvrstoću i performanse filtracije.

4. Pozitivno nabijene membrane od polivinil alkohola (PVA) proizvedene elektrospinovanjem i in situ fotoukrštanjem, koje poboljšavaju hvatanje virusa kroz elektrostatičke interakcije.

5. Slojevite nanokanalne membrane konstruirane od nanostrukturiranih materijala sa samosastavljenim tekućim kristalima (LC), koje predstavljaju novu membransku platformu sa visoko kontroliranom arhitekturom pora i obećavajućom sposobnošću uklanjanja virusa.

Očekuje se da će kontinuirani razvoj ovih naprednih membranskih materijala značajno poboljšati performanse filtriranja virusa, dok se prevazilaze ograničenja konvencionalnih medija za filtriranje.

 

3. Komercijalni virusni filteri

Komercijalni filteri za viruse općenito su dostupni u dvije primarne konfiguracije:

* Moduli membrane od šupljih vlakana

* Membranske kasete sa ravnim{0}}listom

Ovi filteri se obično proizvode od polimera kao što su:

* Hidrofilni poliviniliden fluorid (PVDF)

* Hidrofilni polietersulfon (PES)

* Regenerisana celuloza (RC)

Za razliku od prirodno hidrofilne regenerisane celuloze, PVDF i PES su inherentno hidrofobni materijali. Tokom membranske filtracije, hidrofobne površine imaju tendenciju da adsorbiraju proteine, što može dovesti do začepljenja pora, onečišćenja membrane, smanjenog protoka permeata i na kraju do nižeg povrata proizvoda.

Primarni zagađivači koji se susreću tokom filtracije virusa uključuju proteinske agregate, zaostalu DNK, djelimično denaturirane proteine ​​i druge nečistoće povezane s procesom. Prljanje ne samo da smanjuje efikasnost prečišćavanja, već može negativno uticati na kvalitet finalnog proizvoda. Prema tome, uključivanje odgovarajućeg koraka predfiltracije je efikasna strategija za minimiziranje onečišćenja membrane i produženje vijeka trajanja filtera.

Iako su mnogi filteri za viruse sa šupljim vlaknima tehnički sposobni za rad u načinu filtracije tangencijalnog protoka (TFF), većina komercijalnih procesa filtracije virusa trenutno se izvodi pod uslovima mrtvog{0}}filtracije (DFF).

Murine minute virus (MVM) je široko poznat kao jedan od najizazovnijih modela virusa za validaciju performansi uklanjanja virusa. Shodno tome, biofarmaceutska industrija je široko usvojila 20 nm filtere za zadržavanje-virusa kao standard za validaciju uklanjanja virusa, zamjenjujući filtere s većim veličinama pora.

 

4. Zaključak

Uprkos značajnom napretku u dizajnu membrana i proizvodnim tehnologijama, postizanje konstantno visoke efikasnosti uklanjanja virusa ostaje značajan izazov.

Iako je optimizacija strukture membranskih pora i svojstava materijala poboljšala performanse filtracije, postojeće tehnologije i dalje nailaze na ograničenja pri uklanjanju različitih vrsta virusa, posebno malih ili strukturno jedinstvenih virusa. Jedan mehanizam za isključivanje{1}} fizičke veličine nije dovoljan da ispuni sve zahtjeve za uklanjanje virusa. Stoga će integracija višestrukih mehanizama odvajanja-uključujući elektrostatičku adsorpciju, funkcionalizaciju površine i hemijsku modifikaciju-biti od suštinskog značaja za poboljšanje ukupnog učinka uklanjanja virusa.

Za procese pročišćavanja antitijela, postojeće membrane za uklanjanje virusa i dalje se suočavaju s izazovima vezanim za propusnost membrane, otpornost na zarastanje i efikasnost zadržavanja virusa. Buduća istraživanja bi se trebala fokusirati na inovativne membranske materijale, napredne tehnologije modifikacije površine i optimizirani dizajn procesa kako bi se dodatno poboljšale performanse membrane i ispunili sve strožiji zahtjevi kvaliteta moderne biofarmaceutske proizvodnje.

 

Reference

Luo, X., Ye, H., Li, H., *et al.* Nedavni napredak u primjeni membrana za uklanjanje virusa u procesima prečišćavanja antitijela. *Shandong Chemical Industry*, 2024, 53(19): 153–157. DOI: 10.19319/j.cnki.issn.1008-021X.2024.19.048.