TFF filtracija tangencijalnog protoka u kombinaciji s ultracentrifugiranjem za efikasnu pripremu malih ekstracelularnih vezikula

Male ekstracelularne vezikule (sEV) su vezikule nanorazmjere koje luče stanice koje sadrže nukleinske kiseline, proteine, male molekule i druge komponente i igraju važnu ulogu u međućelijskoj komunikaciji. Mali ekstracelularni vezikuli tipa egzosoma- dijele velike sličnosti sa svojim matičnim ćelijama. U poređenju s umjetnim nanočesticama, one pokazuju niže stope imunološkog uklanjanja i nižu citotoksičnost, što ih čini obećavajućim kandidatima kao novimin vivo vozila za dostavu lijekova. Gotovo sve vrste stanica mogu lučiti ove vezikule, a istraživanja o njihovoj primjeni kao nosačima lijekova postupno se kreću od laboratorijskih prema kliničkim primjenama. međutim,-proizvodnja velikih razmera ostaje glavno usko grlo.

 

Trenutne metode za izolaciju ekstracelularnih vezikula

Trenutne metode izolacije ekstracelularnih vezikula uključujuultracentrifugiranje, centrifugiranje s gradijentom gustine, -ekskluziona hromatografija (SEC) i precipitacija polietilen glikolom (PEG).

Precipitacija PEG nudi visok prinos i jednostavan rad, ali je povezana sa značajnom kontaminacijom neželjenim proteinima. Centrifugiranje s gradijentom gustine i hromatografija{1}}isključivanja veličine mogu obezbijediti proizvode visoke-čistoće, ali njihova efikasnost je relativno niska i procesi zahtijevaju vrijeme-. Ultracentrifugiranje se široko koristi, ali je njegov volumen obrade ograničen kapacitetom centrifuge, što ga čini teškim za povećanje.

 

Primjena filtracije tangencijalnog protoka za separaciju sEV

Tangencijalna protočna filtracija (TFF) već je primijenjena za odvajanje nanočestica kao što su liposomi i lentivirusni vektori. U TFF-u, dovod teče tangencijalno preko površine membrane, što pomaže u smanjenju onečišćenja membrane i čini proces lakšim za povećanje.

Budući da se mali ekstracelularni vezikuli uglavnom kreću od30–200 nmu prečniku, a0,45 μm membranska kasetamože biti odabran u TFF sistemu za uklanjanje većih proteina i vezikula, dok a300 kDa membranska kasetamože se koristiti za uklanjanje proteina male molekularne{0}}težine i koncentriranje malih ekstracelularnih vezikula prisutnih u mediju kulture.

 

Karakterizacija sirovine nakon odvajanja TFF-a

Analiza praćenja nanočestica (NTA) pokazala je da su prečnici čestica uglavnom raspoređeni u rasponu od0–250 nm.

 

 

Međutim, transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) otkrila je veliku količinu kontaminirajućeg proteina, dok nisu uočene ekstracelularne vezikule. Ovi rezultati su pokazali da je potreban dodatni korak prečišćavanja u nastavku za dalje pročišćavanje ekstracelularnih vezikula.

 

Karakterizacija TFF koncentrata nakon ultrafiltracije od 100 kDa

TFF koncentrat je dalje obrađen korištenjem a100 kDa ultrafiltraciona cijev.

NTA je pokazao da su promjeri čestica u koncentratima dobivenim nakon jednog i dva kruga ultrafiltracije uglavnom ostali u rasponu od0–250 nm. Međutim, dvostruko izvođenje ultrafiltracije rezultiralo je značajnim smanjenjem broja dobivenih čestica.

TEM analiza je pokazala da nisu uočene strukture slične vezikuli-u koncentratima za jednokratnu- ili dva- ultrafiltraciju, dok je ostala značajna količina kontaminirajućeg proteina.

stoga,Ultrafiltracija od 100 kDa nije se mogla efikasno koristiti za pročišćavanje medijuma kulture nakon koncentracije TFF.

 

 

Karakterizacija TFF koncentrata pročišćenog ultracentrifugiranjem

NTA je pokazao da su prečnici čestica prečišćenih proizvoda uglavnom raspoređeni u rasponu od0–250 nm.

Važno je da je TEM jasno otkrio strukture poput vezikula-u različitim vidnim poljima. Ovi rezultati su pokazali da nakon koncentriranja medija kulture korištenjem TFF,ultracentrifugiranje se može naknadno koristiti za dalje odvajanje i pročišćavanje ekstracelularnih vezikula.

 

 

Karakterizacija sEV-a izolovanih iz kondicioniranog medija mezenhimalnih matičnih stanica korištenjem TFF-a u kombinaciji s ultracentrifugiranjem

NTA je pokazao da su prečnici čestica prečišćenih proizvoda uglavnom raspoređeni u rasponu od0–250 nm.

TEM je uočio strukture slične vezikuli{0}}. Western blot analiza je pokazala pozitivnu ekspresiju proteina povezanih sa ekstracelularnim vezikulama-CD9, CD63 i ALIXu pročišćenim ekstracelularnim vezikulama.

Ovi rezultati su potvrdili da pročišćeni mali ekstracelularni vezikuli sadrže egzosome, što ukazuje da se ova metoda može koristiti i zaizolacija i ekstrakcija egzosoma.

 

 

Zaključak: TFF u kombinaciji s ultracentrifugiranjem za visoko-kvalitetno sEV pripremu

Studija je to pokazalaSamo koncentracija TFF-arezultiralo je proizvodom koji sadrži značajnu količinu kontaminirajućih proteina i stoga je bio nedovoljan za dobijanje kvalificiranih ekstracelularnih vezikula.

Isto tako, korištenjem a100 kDa ultrafiltraciona cijev za sekundarno prečišćavanjenije efikasno dala intaktne strukture vezikula.

Kombinacijom koncentracije TFF-a s naknadnim ultracentrifugiranim pročišćavanjem, prednosti obje tehnike mogu se integrirati kako bi se dobilovisoko-kvalitetni proizvodi malih ekstracelularnih vezikula.

U poređenju sa samim konvencionalnim ultracentrifugiranjem, kombinovani proces može efikasnosmanjiti ukupno vrijeme obrade i poboljšati efikasnost odvajanja.

U ovom toku rada,TFF omogućava brzo obogaćivanje velikih{0}}semplova, koji se bavi ograničenjem konvencionalnog ultracentrifugiranja u obradi velikih količina uzoraka. Ultracentrifugiranje zatim vrši dubinsko pročišćavanje kako bi se uklonile ko-koncentrirane proteinske nečistoće, dok istovremeno pomaže u održavanju čistoće i integriteta vezikula.

Nadalje, proces ne zahtijeva dodavanjeegzogeni hemijski reagensi za taloženje, pomažući očuvanju biološke aktivnosti vezikula u najvećoj mogućoj mjeri.

Iz perspektive industrijskog prevođenja, ovaj proces je značajanpovećati{0}}potencijali može pomoći u rješavanju izazova povezanih s velikom-proizvodnjom ekstracelularnih vezikula zaisporuka lijekova, regenerativna medicina i razvoj srodnih proizvoda. Također pruža solidnu eksperimentalnu osnovu za naknadnu optimizaciju procesa i pilot{1}}proizvodnju.

 

Referenca

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Uspostavljanje metode za odvajanje malih ekstracelularnih vezikula filtracijom tangencijalnog protoka u kombinaciji sa ultracentrifugiranjem. Kineski časopis za biologiju, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.