Naučni proboj|Proces odvajanja i pročišćavanja rekombinantnog humaniziranog kolagena tipa II

Kolagen tipa II je strukturni protein koji se uglavnom nalazi u tkivu hrskavice. Pruža podršku i amortizaciju za zglobove i pomaže u održavanju mehaničkih svojstava i strukturnog integriteta hrskavice. Ima značajan potencijal primjene u zdravstvu zglobova i inženjeringu tkiva hrskavice.

 

U poređenju sa tradicionalnim metodama ekstrakcije, rekombinantni kolagen proizveden mikrobnom fermentacijom domaćina nudi stabilan kvalitet, dobru biokompatibilnost i nema rizika od virusne kontaminacije, što ga čini glavnim fokusom istraživanja. Rekombinantni humanizirani kolagen tipa II proizveden fermentacijom pomoću konstruirane *Pichia pastoris* privukao je značajan istraživački interes. Međutim, visoka cijena i složenost odvajanja i prečišćavanja ostaju glavni izazovi u uspostavljanju efikasnog procesa za industrijsku-proizvodnju rekombinantnog kolagena.

 

Istraživački tim sa Škole prirodnih nauka i medicinskog inženjerstva na Univerzitetu Anhui, u saradnji sa Anhui Zhongsheng Anlan Health Industry Co., Ltd., razvio je kompletan proces odvajanja i pročišćavanja rekombinantnog humaniziranog kolagena tipa II II-23k na osnovu filtracije tangencijalnog protoka (TAFF) i slabe kolone u kombinaciji sa DE{4} hromatografijom{4} protočni-način rada, pružajući izvodljivo rješenje za proizvodnju velikih razmjera.

 

Završite industrijski{0}}proces prečišćavanja

Cijeli proces se sastoji od četiri glavna koraka:

Filtracija za bistrenje → Koncentracija i dijafiltracija → DEAE kolonski protok-Kroz hromatografiju → Zamrzavanje-Sušenje

 

Slika 1. Proces odvajanja i prečišćavanja rekombinantnog humaniziranog kolagena tipa II II-23k

 

Skrining ključnih procesa

Istraživački tim je uporedio četiri vrste medija za hromatografsku{0}}insku izmjenu: Q jaku anion-izmjenu, DEAE slabu anionsku{2}}izmjenu, SP jaku katjonsku-izmjenu i CM slabu katjonsku{4}}izmjenu kolone.

 

Among them, the DEAE weak anion-exchange column showed the best performance. Under a buffer condition of pH 7.0 , the column was operated in flow-through mode , achieving a target protein purity of >95% and a recovery rate of >90% , bez detektovanih ostataka pigmenata.

 

Procesi razdvajanja i pročišćavanja za različite rekombinantne kolagene eksprimirane od strane različitih mikrobnih domaćina značajno variraju. Općenito, međutim, cjelokupna strategija se može podijeliti na primarno odvajanje i fino prečišćavanje.

 

Svrha primarnog odvajanja je uklanjanje čvrstih suspendiranih tvari kao što su mikrobne ćelije i priprema fermentacijske juhe za naknadno fino prečišćavanje. Ova faza uglavnom uključuje centrifugiranje i filtraciju. Konvencionalne industrijske centrifuge su uglavnom velike veličine, skupe i ograničene brzine rotacije, što rezultira relativno niskom efikasnošću obrade. Tangencijalna filtracija protoka (TFF) ima niže operativne troškove i efikasno smanjuje začepljenje membrane i onečišćenje povezano sa konvencionalnom-filtracijom u mrtvom kraju. Stoga se TFF široko primjenjuje na filtraciju za bistrenje i koncentraciju/dijafiltraciju fermentacijskih bujona koji sadrže rekombinantne proteine.

 

Svrha finog pročišćavanja je dalje poboljšanje čistoće proizvoda uklanjanjem nečistoća kao što su proteini{0}}ćelije domaćina i pigmenti putem hromatografskih tehnika. Među ovim tehnologijama, hromatografija ionske{2}}izmjene nudi visoku rezoluciju i snažnu selektivnost i široko se koristi za -proizvodnju različitih biomolekula.

 

U industrijskoj proizvodnji, jono-izmjenjivačka hromatografija postavlja relativno visoke zahtjeve za bistrenje uzorka i ionsku snagu. U međuvremenu, TFF može podnijeti velike količine sirovog materijala, jednostavan je za održavanje i nudi dobru skalabilnost, što ga čini široko primjenjivim u nizvodnim procesima prečišćavanja bioproizvoda.

 

Stoga, prilikom uspostavljanja procesa odvajanja i prečišćavanja za II-23k, 0,22 μm TFF membrana od šupljih vlakana je korištena za bistrenje filtracije fermentacijske juhe kako bi se uklonile mikrobne ćelije i druge čvrste nečistoće. Za koncentraciju i dijafiltraciju je zatim korištena 5 kDa TFF membranska kaseta sa ravnim -listom, čime je završena predtretman prije hromatografije. Konačno, DEAE kolonska hromatografija u protočnom režimu je korišćena za prečišćavanje.

 

Rezultati su pokazali da je proces bio efikasan, postižući čistoću finalnog proizvoda od približno 95%, bez detektovanih ostataka pigmenata. Ukupna stopa oporavka kompletnog procesa dostigla je skoro 60%.

 

Dalja poboljšanja u oporavku mogu se postići povećanjem zapremine dovoda i smanjenjem očitavanja membranske kasete manometra tokom faze koncentracije i dijafiltracije. Oporavak u koraku hromatografije potencijalno se može poboljšati snižavanjem radne temperature hromatografije i povećanjem koncentracije jona soli u puferu.

 

Referenca

Meng Zixuan, Shi Weiwei, Zhang Maifei, et al. Proces odvajanja i pročišćavanja rekombinantnog humaniziranog kolagena tipa II. *Chinese Journal of Biology*, 2026, 43(1): 91–96.