Ultrafiltracija šupljih vlakana od 300 kd: Analiza visoko-efikasne koncentracije i procesa pročišćavanja za virus-i-o/a bolesti usta i stopala
Sep 03, 2026| Uvod
S-i-bolest (FMD) je akutna, febrilna i vrlo zarazna bolest životinja uzrokovana virusom -i-afleksa (FMDV). Ovaj virus pogađa papkare, sa preko 70 osjetljivih vrsta. Brzo se širi i ima visoku stopu morbiditeta, tipično zahvaćajući glavnu stoku kao što su svinje, ovce i goveda, gdje incidencija može doseći 100%. FMDV pripada roduVirus stopala{0}}i-iz porodice MicroRNAviridae. Čestice su sferne, približno 27-30 nm u prečniku, sa koeficijentom sedimentacije od 146S za intaktne virusne čestice. Trenutno su dostupne različite vakcine protiv FMD-a, uključujući atenuirane žive virusne vakcine, žive virusne vektorske vakcine, inaktivirane vakcine, vakcine sa nukleinskim kiselinama, vakcine sa sintetičkim peptidima i podjedinične vakcine. Inaktivirane vakcine protiv FMD općenito imaju manje nuspojava kod životinja, a multivalentne vakcine nude bolju efikasnost imunizacije, što ih čini glavnim uporištem u prevenciji FMD u Kini.
Ultrafiltracija tangencijalnog protoka
Trenutno je ultrafiltracija tangencijalnog protoka najčešće korištena metoda pročišćavanja i koncentracije u -proizvodnji-i-multivalentnih inaktiviranih vakcina protiv bolesti šapa i šapa. Ova metoda ne samo da postiže željeni faktor koncentracije već i uklanja veliku količinu stranih nečistoća. Tangencijalna protočna ultrafiltracija se uglavnom koristi za pročišćavanje, koncentraciju i filtraciju (odsoljavanje i zamjena pufera). Osim toga, može se koristiti i za bistrenje fermentacijske juhe ili medija za ćelijsku kulturu korištenjem mikrofiltracije tangencijalnog toka, čime se zamjenjuje centrifugiranje ili primarno bistrenje.
U konvencionalnoj vertikalnoj filtraciji, veliki molekuli imaju tendenciju da se agregiraju na površini membrane, začepljujući filter. Tangencijalna filtracija protoka, međutim, omogućava protoku da ide paralelno s membranom, izbjegavajući ovaj problem začepljenja. Za vrijeme filtracije tangencijalnog protoka, otapalo i tvari manje od veličine pora membrane koje prodiru kroz membranu nazivaju se permeat, dok se tvari veće od veličine pora zadržavaju kao koncentrat. U kombinaciji s optimiziranim procesima pranja i filtracije, može se postići odvajanje i pročišćavanje molekula različitih veličina. Ova tehnologija nudi prednosti kao što su niska cijena, blagi radni uvjeti, praktično čišćenje i zamjena, visoka brzina protoka membranskog permeata i jednostavan rad, što je čini posebno pogodnom za veliku-koncentraciju i prečišćavanje bioaktivnih supstanci.
Materijali i metode
Kolona od šupljih vlakana:Granica molekulske težine od 300 kd, površina membrane od 1600 cm².
Materijali:Po 5,6 l supernatanta iz FMDV tipa O i tipa A nakon centrifugiranja i bistrenja.
Parametri procesa:Tokom koncentracije ultrafiltracije, sila smicanja je podešena na približno 3000⁻¹, a TMP je kontroliran da ne bude veći od 10 psi. Kada se faktor koncentracije približi 11 puta, uzorak je ispran 6CV puferskom otopinom. Nakon pranja, sterilni zrak je uveden u ulaznu cijev, a sav koncentrirani uzorak u cijevi je ubrizgan u bocu za koncentraciju uzorka. Zatim je dodan sterilni PBS za ispiranje cijevi sve dok konačni volumen koncentrirane tekućine ne bude 500 mL, čime se poboljšava ukupna stopa oporavka.
Rezultati i diskusija
U smislu početnog pročišćavanja virusa, ultrafiltracijska koncentracija postiže stopu uklanjanja od preko 90% za nečistoće kao što su proteini koji ne sadrže viruse. Što se tiče zapremine, može postići visoke koncentracije od 10-50 puta, pružajući snažnu podršku za naknadno prečišćavanje. Odabrana je kolona od šupljih vlakana sa graničnom molekulskom težinom od 300 kd. Ova veličina pora, zadržavajući preko 85% virusa, može ukloniti preko 90% proteina nečistoća. Površina membrane je 1600 cm², a protok je 2-5 mL/cm², što omogućava da se koncentracija ultrafiltracije završi u efektivnom vremenu (unutar 2 sata). Detaljni podaci o koncentraciji ultrafiltracije i prečišćavanju prikazani su u tabeli 1.
Tabela 1. Rezultati ukupne detekcije antigena bolesti slinavke i šapa (tipovi O i A)
| Sample Name | Tečna hrana | Volumen (mL) | 146S Sadržaj (ug/mL) | 146S stopa oporavka (%) | Koncentracija proteina (ug/mL) | Stopa uklanjanja proteina (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-tip | Originalno rješenje | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-tip | Koncentriraj se | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| A-tip | Originalno rješenje | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| A-tip | Koncentriraj se | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Razmatranje metode pročišćavanja
Trenutno postoje različite metode prečišćavanja, ali čak i sa istom metodom za isti antigen, učinak pročišćavanja je često nezadovoljavajući iz više razloga, uključujući karakterizaciju antigena i parametre procesa. Na primjer, promjene u uzvodnom molekularnom dizajnu ili sistemima kulture fermentacije mogu promijeniti virusnu molekularnu strukturu, što dovodi do nezadovoljavajućih rezultata pročišćavanja. Neodgovarajuće metode bistrenja mogu povećati troškove sirovina ili količinu heterolognog proteina, povećavajući pritisak na dalje prečišćavanje. Neodgovarajuća koncentracija ultrafiltracije, kao što su različite veličine pora ultrafiltracione membrane, faktori koncentracije i elucije, ulazne brzine protoka, brzine filtracije i TMP, mogu rezultirati niskim stopama obnavljanja antigena. Opsežna praksa pokazuje da loše pročišćavanje može izazvati značajne neželjene reakcije kod životinja nakon imunizacije, potencijalno dovesti do smrti.
zaključak:Ova studija pokazuje da, u procesima tangencijalnog protoka, odabirom odgovarajuće veličine pore membrane (300 kd), omjera ispiranja, ulaznog protoka i TMP, može se osigurati i visoka stopa obnavljanja i maksimalno uklanjanje nečistoća.